目的

檢測生產(chǎn)車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機(jī)械設(shè)備的微生物指標(biāo)，生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境當(dāng)中病原微生物的監(jiān)控，達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，以控制食品成品的質(zhì)量。

一、參考標(biāo)準(zhǔn)

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 15979-2002、《HACCP原理與實施》、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《公共場所空氣微生物檢驗方法細(xì)菌總數(shù)測定》GB/T 18204.1-2013、出入境檢驗檢疫局2004年《出入食品微生物檢驗培訓(xùn)教材》中《出入食品生產(chǎn)廠衛(wèi)生細(xì)菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。

二、采樣與檢測方法

A.空氣的采樣與測試方法

1.樣品采集：

取樣頻率：

a.車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進(jìn)行采樣，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。

b.全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進(jìn)行采樣。

c.產(chǎn)品檢驗結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)及時對車間進(jìn)行采樣，如有檢驗不合格點，整改后再進(jìn)行采樣檢驗。

d.實驗性新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定頻率采樣檢驗。

e.正常生產(chǎn)狀態(tài)的采樣，每周一次。

2.采樣方法

在動態(tài)下進(jìn)行，室內(nèi)面積不超過30m2，在對角線上設(shè)里、中、外三點，里、外點位置距墻1m;室內(nèi)面積超過30m2，設(shè)東、西、南、北、中五點，周圍4點距墻1m。采樣時，將含平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的平板(直徑9cm)置采樣點(約桌面高度)，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5min。采樣后必須盡快對樣品進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測，送檢時間不得超過4h，若樣品保存于0～4℃條件時，送檢時間不得超過24h。

3.菌落培養(yǎng)：

a.在采樣前將準(zhǔn)備好的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板置36℃±1℃ 培養(yǎng)24h，取出檢查有無污染，將污染培養(yǎng)基剔除。

b.將已采集樣品的培養(yǎng)基在4h內(nèi)送實驗室，菌落總數(shù)于36℃±1℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，計數(shù)平板上細(xì)菌菌落數(shù)。

4.菌落計算：

a.記錄平均菌落數(shù)，用“CFU/皿”來報告結(jié)果。用肉眼直接計數(shù)，標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。

b.若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。

B.工作臺(機(jī)械器具)表面與工人手表面采樣與測試方法：

1.樣品采集：

①取樣頻率：

a.車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進(jìn)行擦拭檢驗，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。

b.全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進(jìn)行全面擦拭檢驗。

c.產(chǎn)品檢驗結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)及時對車間可疑處進(jìn)行擦拭，如有檢驗不合格點，整改后再進(jìn)行擦拭檢驗。

d.實驗新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定擦拭頻率擦拭檢驗。

e.對工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時，進(jìn)行擦拭檢驗。

f.正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭，每周一次。

②采樣方法：

a.工作臺(機(jī)械器具)：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面(取與食品直接接觸或有一定影響的表面)取25cm2的面積，在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。

b.工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。

③采樣注意事項：

擦拭時棉簽要隨時轉(zhuǎn)動，保證擦拭的準(zhǔn)確性。對每個擦拭點應(yīng)詳細(xì)記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環(huán)節(jié)的消毒時間。

2.細(xì)菌·大腸菌群的檢測培養(yǎng):

樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如污染嚴(yán)重，可十倍遞增稀釋，吸取1ml 1：10樣液加9ml無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。

(1)菌落總數(shù)：

a.以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿(平行樣)，將已融化冷至45℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15~20ml，充分混合。

b.待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃ 培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

c.結(jié)果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù) 。

(2)大腸菌群：

①平板法:

a.以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿(平行樣)，將VRBA培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15~20ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養(yǎng)基，約3-5 ml。

b.待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃ 培養(yǎng)24h后計數(shù)。

c.證實實驗：從VRBA平板上挑取典型和可疑菌落接種BGLB進(jìn)行證實實驗。

d. 結(jié)果計算：經(jīng)*后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以平板上出現(xiàn)的典型和可疑菌落個數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得出。

e.結(jié)果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)。

②MPN法:

a. 以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到LST肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。

b.置LST肉湯管于36℃±1℃培養(yǎng)48±2h。記錄所有LST肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。

c.選擇產(chǎn)氣渾濁的發(fā)酵管接種BGLB進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實驗。

d.結(jié)果報告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

(3)金黃色葡萄球菌檢測

①定性檢測

a.取1ml 稀釋液注入滅菌的平皿內(nèi)，傾注15-20ml的B-P培養(yǎng)基，(或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板)，放進(jìn)36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2小時。

b.從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。

c.結(jié)果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性，即報告手(工器具)上有金黃色葡萄球菌存在。

②定量檢測

a.以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到含7.5﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。

b.置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃ 培養(yǎng)45～48小時。

c.從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)20～24小時。

d.取肉湯培養(yǎng)物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結(jié)果。

e.報告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗結(jié)果，查MPN表報告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

C.工廠環(huán)境中病原體的檢測計劃與方法

檢測計劃：為了保證食品安全，工廠應(yīng)該對生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進(jìn)行檢測和評估，檢測項目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗室應(yīng)該按照一定的計劃對生產(chǎn)場所環(huán)境中的病原體進(jìn)行檢測，其中包括地面、下水道、 排水溝、墻壁、天花板、設(shè)備框架、運輸?shù)闹Ъ埽洳匮b置、速凍機(jī)、傳送帶、設(shè)備的螺絲、維修工具等部位。當(dāng)某個點檢測到病員微生物時，應(yīng)該對環(huán)境中的相似點加大檢測頻率;在把所有的預(yù)定點檢測完后，應(yīng)該對環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進(jìn)行全面評估，在下一次環(huán)境檢測循環(huán)過程中加強(qiáng)檢測容易出現(xiàn)病原體的環(huán)境點，達(dá)到持續(xù)改進(jìn)的目的。

檢測頻率: 每月兩次,每次每個區(qū)域至少選取5個檢測點,分別進(jìn)行檢測。

1.環(huán)境李斯特菌的檢測方法(3MTM PetrifilmTM 環(huán)境李斯特菌的測試片)

(1)用涂抹棒，海綿或者其他采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。

(2) 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫(20-30℃)1小時，*久不超過1.5小時，以修復(fù)損傷的李斯特菌。

(3) 將測試片放在平坦處，掀起上層膜。

(4) 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。

(5) 輕輕將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上，不要壓，扭轉(zhuǎn)或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。

(6) 將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養(yǎng)26-30小時，可以用標(biāo)準(zhǔn)菌落記數(shù)器或者其他光學(xué)放大器判讀，不要記數(shù)圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養(yǎng)基的影響。

(7) 對于定性檢測，根據(jù)紫紅色菌落是否存在，結(jié)果記為檢出或者未檢出。

2.環(huán)境中沙門氏菌的檢測方法

(1)采樣地點: 選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方。

(2)操作步驟

a.采樣應(yīng)在生產(chǎn)開始后進(jìn)行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉(zhuǎn)涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。

b.將樣品帶回實驗室，每5個點混合成一個樣品, 登記編號,按照標(biāo)準(zhǔn)及時檢測，若有陽性結(jié)果出現(xiàn)，應(yīng)逐步對所混合的每個點分別檢測。