米酵菌酸，化學(xué)名為：3-羧甲基-17-甲氧基-6，18，21-三甲基-廿二碳-2，4，8，12，14，18-七烯二酸。

20世紀(jì)30年代國(guó)外從引起人中毒的椰子發(fā)酵食品樣品中提取出該毒素，并對(duì)該毒素的理化性質(zhì)和致毒機(jī)制進(jìn)行了大量研究，近年來(lái)米酵菌酸又作為研究抗腫瘤疾病和細(xì)胞凋亡的一種工具試劑來(lái)使用。我國(guó)70年代從酵米面中毒樣品中分離出一種稱(chēng)為“酵米面黃桿菌”(Flavobacterium farinofermen-tans no sp)的食物中毒菌，其產(chǎn)生的外毒素-酵米面黃桿菌毒素A(簡(jiǎn)稱(chēng)黃桿菌毒素A,flavotoxin A)現(xiàn)證明即為米酵菌。

毒性

BA作為酵米面中毒和銀耳中毒的病原菌產(chǎn)生的毒素之一,具有很強(qiáng)的生物活性,是椰毒假單胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產(chǎn)物。臨床癥狀表現(xiàn)為惡心嘔吐、腹痛腹脹等,重者出現(xiàn)黃疸、腹水、皮下出血、驚厥、抽搐、血尿、血便等肝腦腎實(shí)質(zhì)性器官損害癥狀。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦表明,BA主要作用于肝、腦和腎等實(shí)質(zhì)性臟器且以細(xì)胞內(nèi)的線粒體*為敏感。國(guó)外有研究表明BA作用于胰腺β細(xì)胞抑制葡萄糖引起的電活性而造成高血糖,此后又可轉(zhuǎn)為低血糖,嚴(yán)重者出現(xiàn)低血糖昏迷。BA除對(duì)線粒體有破壞作用外,還可使部分巰基酶失活,因此解毒時(shí)可使用L-半胱氨酸等巰基化合物恢復(fù)由BA所抑制的巰基酶活性，減輕或解除BA的毒害。此外BA具有抑菌作用,對(duì)霉菌、酵母及某些細(xì)菌均有強(qiáng)烈的抑制和殺滅作用,12.5μg量的BA即可在平板上形成明顯的抑菌圈。

檢測(cè)方法

1. 國(guó)標(biāo)法

GB 5009.189《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》

(1)原理

試樣經(jīng)提取、凈化、濃縮及過(guò)濾后,經(jīng)高效液相色譜儀分析,外標(biāo)法定量。

(2)材料

固相萃取柱:陰離子交換柱(60mg/3mL)或等效品,臨用前依次加5.0mL甲醇和5.0mL水活化,保持柱體濕潤(rùn)。

米酵菌酸:純度≥95%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.1mg/mL):準(zhǔn)確稱(chēng)取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品1mg(精確至0.01mg),用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。置于2°C~8°C冰箱中避光保存,有效期為6個(gè)月。

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液:分別吸取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋定容,配制成米酵菌酸濃度分別為0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。臨用時(shí)配制。

(4)分析步驟

A.固相萃取法：

提取：干試樣經(jīng)粉碎過(guò)φ0.425mm篩后,稱(chēng)取20g(精確至0.01g)置于錐形瓶中,加入100mL甲醇-氨水溶液;鮮(濕)試樣經(jīng)剪碎、勻漿后稱(chēng)取10g(精確至0.01g),加入80mL甲醇-氨水溶液。混勻,室溫下避光浸泡1h,置于超聲波振蕩器中超聲提取約30min,過(guò)濾。干試樣取濾液50mL,鮮(濕)試樣取濾液40mL。置80°C水浴中濃縮至約3mL,待凈化。

凈化：將濃縮后的試樣全部轉(zhuǎn)移到已活化的固相萃取柱中,依次用5mL水和5mL甲醇淋洗,棄去流出液,抽干萃取柱,再用6mL甲酸-甲醇溶液(2%)洗脫,收集洗脫液,于40°C±0.5°C水浴中氮吹至干,然后加入0.5mL甲醇,渦旋溶解,混勻,經(jīng)微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。

B.液-液萃取法

提取：干試樣經(jīng)粉碎過(guò)φ0.425mm篩后,稱(chēng)取20g(精確至0.01g),置于具塞錐形瓶中,加入20mL甲醇,室溫下避光浸泡1h,再加入80mL三氯甲烷和0.2mL磷酸溶液(45.4%);鮮(濕)試樣經(jīng)剪碎、勻漿后稱(chēng)取10g(精確至0.01g),加入16mL甲醇,于室溫下避光浸泡1h,再加入64mL三氯甲烷和0.16mL磷酸溶液(45.4%)。振蕩30min,過(guò)濾,干試樣取濾液50mL,鮮(濕)試樣取濾液40mL。

萃取：將上述濾液分別移入150mL分液漏斗中,加入與濾液等體積的碳酸氫鈉溶液(40g/L),振搖2min,靜置待分層后,取出下層于另一分液漏斗中;再用碳酸氫鈉溶液(40g/L)10mL重復(fù)提取兩次,輕搖;將三次提取的碳酸氫鈉溶液合并,加入25mL三氯甲烷,振搖2min,靜置分層后棄去三氯甲烷,于分液漏斗中慢慢加入鹽酸溶液(6mol/L)調(diào)該溶液pH至2~3,加入石油醚50mL(鮮、濕試樣為40mL),振搖3min,靜置分層,取出石油醚層于旋蒸瓶中,再分別用石油醚30mL和20mL各提取一次(鮮、濕試樣兩次均為20mL),將石油醚層并入同一瓶中,于40℃±0.5℃水浴中旋蒸濃縮至干,用少量甲醇分次將旋蒸瓶中提取物溶解并轉(zhuǎn)移至5.0mL玻璃離心管或濃縮瓶中,于40℃±0.5℃下氮吹濃縮至干,然后加入0.5mL甲醇,渦旋溶解,混勻,經(jīng)微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。

(5)色譜參考條件

色譜參考條件列出如下:

a) 色譜柱:C18色譜柱(柱長(zhǎng)250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒度5μm)或同等性能的色譜柱;

b) 流動(dòng)相:甲醇+水=75+25,水用冰乙酸調(diào)pH 至2.5;

c) 流速:1.0mL/min;

d) 柱溫:30℃;

e) 檢測(cè)波長(zhǎng):267nm;

f) 進(jìn)樣量:20μL。

(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別將 20μL米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相色譜儀中,測(cè)定相應(yīng)的峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣溶液的測(cè)定將試樣溶液注入液相色譜儀中,以保留時(shí)間定性,同時(shí)記錄峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中米酵菌酸的濃度。

(7)分析結(jié)果的表述試樣中米酵菌酸含量按式(1)計(jì)算:

X=(ρ×V×2)/m..............................(1)

式中:

X ———試樣中米酵菌酸的含量,單位為微克每克(μg/g);

ρ ———由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中米醇菌酸的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);

V ———試樣溶液的濃縮定容體積,單位為毫升(mL);

2 ———稀釋倍數(shù);

m ——— 試 樣 質(zhì) 量 ,單 位 為 克 (g)。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

(8)精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的**差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

(9)其他

方法檢出限為0.005μg/g,定量限為0.015μg/g。

2. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定銀耳中的米酵菌酸。樣品采用甲醇提取，混合強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱(PAX)凈化，UPLC BEH C(2.1×100 mm，1.7 μm)色譜柱分析，以 10 mmol/L 乙酸銨-乙腈為流動(dòng)相，梯18度洗脫，串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，米酵菌酸在 1.6 μg/L~80 μg/L 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r)0.999 9，檢出限 0.5 μg/kg，加標(biāo)回收率 82 %~102 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD≤8.5 %。該方法快捷準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于銀耳中米酵菌酸的確證方法。

3. 其他測(cè)定方法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-二*管陣列檢測(cè)器結(jié)合固相萃取法等新型方法。