含量測量是核酸測量的首要問題，世界工業(yè)先進國家計量機構均已針對核酸含量測量開展了基礎研究和應用研究。核酸含量測量應用廣泛，包括實時定量PCR技術、基因芯片、電化學傳感器和納米技術等。這些技術領域質控體系的建立，需要依照權威測量和計量方法研制相應的標準物質，通過標準物質的使用保證核酸測量量值的溯源與傳遞。

　　目前國際上現(xiàn)有的具有明確溯源途徑的高準確性核酸測量方法有酶解DNA產物的液相色譜–串聯(lián)同位素稀釋質譜方法HPLC–IDMS[1–4]和DNA中磷元素的電感耦合等離子體發(fā)射光譜法ICP–OES[5–7]。

　　DNA酶解法可適用于長片段核酸，但依賴于DNA水解酶的活性，而酶活性受酶解底物濃度的影響[8]。遇到核酸卷曲、核酸與蛋白質結合[9]、堿基修飾[10]等因素造成的特殊空間構象時，核酸水解酶無法進入而無法水解[8]。酶解反應使DNA測量體系內混入大量的蛋白質、無機鹽、兩性電解質等物質，純化過程容易導致DNA損失。文獻報道，DNA酶解反應容易反應不完全，導致*終測量結果偏低[10]。DNA中磷元素的電感耦合等離子體光譜法(ICP–OES)適用于短片段、純度很高的DNA樣品。如果DNA測量體系中混有其它元素狀態(tài)的磷，如無機鹽中的磷元素，則會造成DNA測量結果偏高[5]。

　　加熱可使得某些帶修飾的堿基從DNA骨架上解離出來成為游離堿基[11]。在強酸如HCl條件下，DNA上的堿基與核糖連接的糖苷鍵斷裂，形成游離堿基[12]，但是容易產生副產物。弱酸(如甲酸)在加熱條件下可使得DNA上腺嘌呤和鳥嘌呤及其修飾加合物解離為游離堿基[13–14]，該過程也可解離出游離胞嘧啶和甲基胞嘧啶，用于DNA甲基化水平研究[15]。在此基礎上，筆者建立了DNA水解產物的HPLC–IDMS定量方法。

　　核酸的酸水解方法有以下優(yōu)點：

　　(1)酸解反應耗時較短，反應充分;

　　(2)酸解切斷的是堿基與核糖之間的糖苷鍵[13]，不受DNA長度、序列、DNA上結合的蛋白質等因素的影響，水解過程進行較充分;

　　(3)酸解反應不引入雜質，只有甲酸中攜帶的痕量金屬離子，易于采用液相色譜串聯(lián)同位素稀釋質譜的分離分析。然而酸解法也有一定的缺點，高濃度強酸可能使DNA的水解產生其它反應副產物，可能造成堿基進一步降解[16]。因此需要利用選擇酸的類型、酸的濃度、酸解時間與溫度，準確控制酸水解效率，以實現(xiàn)DNA含量的準確測量。

　　噬菌體λDNA是一種廣泛應用的核酸含量標準品，常用于DNA紫外或熒光定量方法的校準。噬菌體λDNA的提取純化過程需要先分離病毒顆粒，因此很少受到細菌本身基因組DNA和RNA的污染，可以獲得較純凈的噬菌體DNA[17]，適合作為標準物質候選物。

　　1實驗部分

　　1.1主要儀器與試劑

　　水浴鍋：DK–8D型，上海一恒科學儀器有限公司;

　　pH計：Origin3Star型，美國ThermoScientific公司;

　　旋渦振蕩儀：MS3型，德國IKA公司;

　　真空干燥箱：DZF–6050型，上海精宏實驗設備有限公司;

　　恒溫烘箱：UFE500型，德國Memmert公司;

　　離心機：3–15K型，美國Sigma公司;

　　純水機：MilliQ型，美國Millipore公司;

　　分析天平：CP324S型，感量為0.01mg，德國Sartorius公司;

　　精密分析天平：UMX2型，感量為0.1μg，瑞士MettlerToledo公司;

　　電噴霧三重四級桿質譜儀：TSQVantage型，美國ThermoScientific公司;

　　SDS、酚、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、無機酸、無機鹽：分析純或優(yōu)級純;

　　乙腈、甲醇：色譜醇，美國J.T.Baker公司;

　　純度標準物質：自制，分別是腺嘌呤(Ade)[純度為(99.40±0.68)%，k=2]，胞嘧啶(Cyt)[純度為(99.58±0.72)%，k=2]，鳥嘌呤(Gua)[純度為(99.96±0.18)%，k=2]，胸腺嘧啶(Thy)[純度為(99.67±0.24)%，k=2]。其中腺嘌呤和胞嘧啶分別采用電位滴定法定值，量值溯源至酸堿國家基準，鳥嘌呤和胸腺嘧啶采用液相色譜面積歸一化法定值;

　　同位素標記物：13C，15N雙標記堿基，同位素標記腺嘌呤(L-Ade)化學式為1，3-15N298%，同位素標記胞嘧啶(L-Cyt)化學式為2，4-13C2，15N3(99%C，98%N)，同位素標記鳥嘌呤(L-Gua)化學式為8-13C，7，9-15N2(98%C，98%N)，同位素標記胸腺嘧啶(L-Thy)化學式為1，3-15N2，98%，均購自劍橋同位素實驗室(CambridgeIsotopeLabotory)公司。

　　1.2儀器工作條件

　　1.2.1色譜條件

　　色譜柱：AcqurityUPLCHSST3色譜柱(100mm×2.1mm，1.8μm，美國Waters公司);

　　流動相：A為5mmol/LNH4Ac(0.1%HAc，pH4.0)，B為乙腈,水相配制后用0.45μm濾膜抽濾，并超聲脫氣;

　　柱溫：30℃;進樣體積：3μL;

　　流速：120μL/min;梯度洗脫：0～9min99%A，9～9.5min99%～80%A，9.5～12.5min80%A,12.5～13min80%～99%A，13～18min99%A。

　　1.2.2質譜條件

　　正電模式;噴霧電壓：3.0kV;霧化氣：N2;霧化氣溫度：200℃;鞘氣壓力傳感器參數(shù)：20arb;輔助氣壓力傳感器參數(shù)：5arb;毛細管溫度：350℃;碰撞氣：Ar;一級質譜掃描寬度(m/z)：0.002;掃描時間：0.1s;一級質譜半峰寬(FWHW)：0.7;二級質譜半峰寬：0.7;微掃描時間：1ms。質譜多反應監(jiān)測模式(MRM)的樣品離子監(jiān)測條件(包括同位素堿基標記物)見表1。按質譜儀說明書配制含有咖啡因、MRFA(多聚酪氨酸短肽)和MLtramarkl621的質量軸校準液，完成質譜儀的校準。

　　1.3標準溶液和樣品溶液的配制

　　稱取約1mg堿基和同位素標記的堿基，分別溶于10mL去離子水中，配制成標準儲備液。Gua和L-Gua不易溶于水，溶于體積分數(shù)3%的鹽酸溶液中，然后配制成混合標準品和混合同位素標記內標品。根據(jù)λDNA用HPLC外標法測得的濃度，在溶液中添加約等量的混合同位素標記內標品，同時配制與樣品濃度近似的堿基與同位素標記堿基質量比值約為0.90和1.10的高標和低標溶液。

　　1.4DNA水解

　　將基因組DNA含量標準物質候選物凍干粉溶于100μL水，在λDNA溶液中添加與其組成成分核苷酸含量相近的標記核苷酸混合物。量取100μL樣品溶液于安瓿瓶中，真空干燥箱抽干。加入200μL甲酸水溶液(體積分數(shù)為88%)，充氮氣，封口。在170℃恒溫烘箱內反應30min，冷卻后用真空干燥箱抽干，量取加入100μL0.1mol/L鹽酸溶解，充分溶解混勻，溶液于4℃下保存。

　　1.5IDMS法堿基含量的計算

　　針對每一種堿基：

　　式中：

　　c——堿基質量分數(shù);

　　h——水解效率，%;

　　P——堿基標準物質的純度，%;

　　mr——樣品中堿基同位素標記物的質量，g;

　　Rs——樣品中堿基與堿基標記物的峰面積比;

　　I1——高標溶液堿基與堿基標記物的質量比;

　　I2——低標溶液堿基與堿基標記物的質量比;

　　R1——高標溶液堿基與堿基標記物的峰面積比;

　　R2——低標溶液堿基與堿基標記物的峰面積比;

　　m——樣品質量，g。

　　1.6λDNA含量的計算

　　由于λDNA是一個具有49.5kb長度的雙鏈閉環(huán)DNA。Cyt，Gua，Thy，Ade4種堿基質量分數(shù)分別為8.96%，12.19%，10.23%，10.97%，根據(jù)4種堿基含量計算得λDNA總質量，取平均值，得到同位素稀釋堿基法測量DNA質量的值。

　　2結果與討論

　　2.1DNA水解條件的優(yōu)化

　　分別用5%鹽酸溶液于110℃水解24～48h，用88%甲酸水溶液于140℃水解2～16h，用88%甲酸水溶液于170℃水解15min～4h[13–14]。試驗結果表明，鹽酸水解產物雜質較多;甲酸140℃水解胸腺嘧啶核苷一磷酸的水解不完全;甲酸170℃水解效果較好，水解反應完全。用88%甲酸水溶液于170℃水解30min回收率滿足要求，水解產物中4種堿基保持穩(wěn)定，因此水解條件優(yōu)化為88%甲酸水溶液于170℃水解30min。

　　2.2水解效率

　　根據(jù)核苷酸和基因組DNA水解實驗的回收率計算酸水解回收率。微生物基因組DNA提取樣品中定量加入已知濃度的5種堿基混合物質控品，以1.4步驟水解樣品并進行測定，重復測量7個樣品，計算回收率，結果表明4種待測物堿基的回收率都在95%以上，水解效率不確定度不大于0.8%。經過t檢驗，4種dNMP溶液與λgDNA溶液添加dNMP溶液后水解測量的回收率無顯著性差異。另外，經過Picogreen熒光染料實驗，水解產物沒有出現(xiàn)熒光反應，說明水解產物中已不含有雙鏈DNA，即說明水解反應完全。

　　2.3色譜與質譜參數(shù)的優(yōu)化

　　測試不同NH4Ac溶液濃度和不同pH值條件下4種堿基的分離效果，結果表明，pH值越大，堿基保留時間越長;有機相比例越高，堿基保留時間越短?？紤]出峰時間、色譜柱的耐受性和流動相對質譜的影響，確定了1.2.1色譜條件。配制0.01mg/g同位素標記的堿基和非標記堿基的混合物，進行流動注射，選定合適的噴霧電壓和毛細管溫度，并且優(yōu)化S-lens和碎裂CID電壓，考慮質譜的掃描速度、分析時間，獲得盡可能大的信號強度，確定了1.2.2質譜條件。利用樣品與同位素標記物混合后水解的產物進行HPLC–IDMS實驗，樣品總離子流圖和子離子流圖分別見圖1~圖5。

　　2.4樣品中堿基含量的同位素稀釋質譜法測定

　　取15支λDNA凍干粉樣品，稱量后溶于100μL去離子水中，然后量取100μL樣品溶液，加入100μL同位素標記混合樣，充分混勻。參照1.4步驟進行實驗，結果列于表2，由表2可知，4種堿基測量結果的相對標準偏差都在5%以內。

　　按照1.6λDNA計算方法，依據(jù)不同核苷酸在整個λDNA序列中的比例計算λDNA含量，將4種核苷酸堿基推算所得DNA含量取平均值，并與數(shù)字PCR(dPCR)測量結果相比較[18]，結果見圖6。λDNA的測量結果為每支(2.51±0.06)μg

　　(k=2)。由圖6可見，兩種不同原理的測量方法所得結果近似，測量值在不確定度范圍內。