作者:Lance 時間:2022-10-18 來源:互聯(lián)網
蛋白質被認為是構成生物體細胞組織的重要成分。食物中的蛋白質是人體中氮的**來源,具有糖類和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白質區(qū)別于其他有機化合物的重要標志。在檢驗食品中蛋白質時,通常是先檢定出食品中的總氮量,然后乘以蛋白質換算系數(shù),以此得到蛋白質含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年**提出,至今仍被作為標準檢驗方法。凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。
原理
向樣品中加入濃硫酸和催化劑,充分混勻,然后加熱消化分解,樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水,其中的有機氮轉化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),即為蛋白質的含量。
樣品消化
濃硫酸具有脫水性和氧化性,可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水,蛋白質會分解為氨,然后氨與硫酸結合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點,一般情況下,純硫酸的沸點在340℃左右,但是在添加硫酸鉀后,可提高至400℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀,否則會因為溫度過高,使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外,還可以指示消化終點的到達,有機物全部消化完全后,溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色,硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應的指示劑。
蒸餾
消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會轉化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出,影響測定結果,所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽,需要足夠的堿液使結合態(tài)的氨完全反應并釋放出來,這個過程中的氫氧化鈉一定要過量,過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀,氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成,可用奈氏試紙法,NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。
吸收
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收,硼酸有吸收氨的作用,又因其呈微弱酸性,不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱,從而造成損失,故一般不超過40℃。
滴定
待吸收完全后,用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸堿滴定,滴定液的濃度直接影響結果的準確性,必須按照要求進行配制和標定?;旌现甘緞┰谥行匀芤褐谐驶疑味ńK點時液體呈灰色。
注意事項
①所用的試劑溶液應用無氨蒸餾水配制;
②取樣應具有代表性,取樣前將樣品充分混勻;
③樣品稱量放入凱氏燒瓶時,切勿使樣品粘附在瓶頸部,避免樣品未消化完全而造成氮損失;
④為了保證使燒瓶壁上的殘渣消化完全,在消化過程中要不時地轉動凱氏燒瓶;
⑤消化脂肪或糖含量較高的樣品時,易產生大量泡沫,為防止泡沫溢出,消化時應先消化加熱并不斷搖動,或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑;
⑥當樣品消化液渾濁或未澄清透明時,可先將凱氏燒瓶放冷至室溫后,再加入30%的過氧化氫,然后繼續(xù)加熱消化;
⑦加堿后,漏斗要進行水封,避免因裝置漏氣造成氨的逸出影響結果的準確性;
⑧要保證蒸餾裝置不能漏氣;
⑨在蒸餾時反應室與外界存在的壓力差,蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時,要保證蒸汽均勻、充足,中間不能停止加熱,防止發(fā)生倒吸;
⑩蒸餾前如果加堿后消化液呈藍色而沒有生成氫氧化銅沉淀,說明加入的堿量不足,需要適量補加堿;,蒸餾時為防止水蒸氣發(fā)生器內液體爆沸,加入幾片碎瓷片或大的玻璃珠,玻璃珠直徑*好大于聯(lián)通的玻璃管直徑,以免玻璃珠進入玻璃管內影響蒸汽均勻、充足的輸出;冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下,防止氨逸出,蒸餾完畢后先將冷凝管下端提離液面,再蒸1min后清洗管口,再移開吸收瓶,*后關掉熱源,否則可能發(fā)生倒吸。
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