1 范圍

本標準規定了玉米及其加工產品中轉基因成分檢測的PCR方法和實時熒光PCR方法。

本標準的篩選檢測適用于玉米及其加工產品中轉基因成分的定性檢測。

本標準的鑒定檢測適用于玉米MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA2l、MON863、NK603TC507、MON88017、59122、MIR604、MIR162、DBT418、MON89034、LY038、ES3272、Bt10、DP98140品系轉基因成分的定性檢測。

2 規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法

GB/T 19495.1 轉基因產品檢測 通用要求和定義

GB/T 19495.2 轉基因產品檢測 實驗室技術要求

GB/T 19495.3 轉基因產品檢測 核酸提取純化方法

GB/T 19495.7 轉基因產品檢測 抽樣和制樣方法

3 術語、定義和縮略語

3.1 術語和定義

GB/T 19495.1 界定的以及下列術語和定義適用本文件。

3.1.1 轉基因 transgene

將物種本身不具有的來源于其他物種的功能DNA序列，通各種導入手段，使其在該物種中進行表達，以便該物種獲得新的品種特征。

3.1.2 內源基因 endogenous gene

在栽培的物種中拷貝數恒定的、不顯示等位基因變化的基因。該基因可用于對基因組中某一目的基因的定量分析。

3.2 縮略語

GB/T 19495.1 界定的以及下列縮略語適用于本文件。

CaMV35S:35 S promoter from Cauliflower moshic virus，來自于花椰菜花葉病毒的35S啟動子。

CDPK: calcium-dependent protein kinase(CDPK)gene，鈣依賴蛋白激酶基因

CrylA(b): a synthetic gene encodes the first 648 amino acids， insecticidal-active truncated product identical to that of cryLA(b) gene of Bacillus thuringiensis subsp。蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白 cryIA(b)基因

CrygC： insecticidal-active truncated product identical to that of Cry 9C gene of Bacillus thuringiensis subsp，蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白Cry9C基因

Ct值：C： Cycle，t; threshold，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數

EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸

HSP70：0.8 Kb intron from the hsp70gene(heat- shock protein)，來自熱休克蛋白(hsp70)基因的0.8Kb基因內區

IVR：invertase 1 gene from maize，玉米的轉化酶1基因

IvS2：intron from the maize alcohol dehydrogenase gene，玉米乙醇脫氫酶基因的基因內區2

mEPSPS：maize5- enolypyruvylshikimate-3 phosphate synthase，來源于玉米的莽草酸羥基乙酰轉移酶

NOS：terminator of nopaline synthase gene，胭脂堿合成酶基因終止子

NPTI：neomycin-3′- phosphotransferase gene，新霉素-3′-磷酸轉移酶基因

OTP：optimized transit peptide gene，優化運輸肽基因

P actin1：the promoter derived from the rice( Orya sativa) actin 1 gene，來源于玉米肌動蛋白1基因的啟動子

PAT：phosphinothricin acetyltransferase gene，草丁膦乙酰轉移酶基因

PCK：polymerase chain reaction，簡稱PCR

TE：Tris-HCl、EDTA緩沖液

Tris：tris( hydroxymethyl) aminomethane，三(羥甲基)氨基甲烷

Taq：Thermus aquatica，水生熱棲菌

zein：玉米醇溶蛋白基因

4 防污染措施

檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2 中的規定執行。

5 抽樣和制樣

5.1 取樣

按照GB/T 19495.7 中規定的方法執行。

5.2 制樣

稱取約50g玉米樣品，經干熱滅菌(150℃干熱預處理2h)或120℃、30min高壓消毒處理的碾缽或粉碎機中碾磨至樣品粉末顆粒約0.5mm左右大小。

6 普通PCR方法

6.1 原理

樣品經過提取DNA后，針對轉基因植物所插入的外源基因的基因序列設計引物，通過PCR技術特異性擴增外源基因的DNA片斷，根據PCR擴增結果，判斷該樣品中是否含有轉基因成分。

6.2 試劑和材料

除另有規定外，其他試劑為分析純或生化試劑，水為按照GB/T 6682 規定的一級水。

6.2.1 引物：檢測轉基因玉米內、外源基因的引物及其信息見附錄A。

6.2.2 Tag dna聚合酶。

6.2.3 dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP。

6.2.4 瓊脂糖：電泳純。

6.2.5 溴化乙錠(EB)或其他染色劑。

6.2.6 三氯甲烷

6.2.7 異戊醇。

6.2.8 異丙醇。

6.2.9 70%乙醇。

6.2.10 相對分子質量 Marker：50bp~300bp。

6.2.11 CTAB裂解液：3%(質量濃度)CTAB，1.4mol/LNaC，0.2%(體積分數)巰基乙醇，20mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH8.0

6.2.12 TE緩沖液：10mmol/ L Tris-HCl，pH8.0;1mmol/ L EDTA，pH8.0。

6.2.13 10×PCR緩沖液：100m mol/LKCl，160m mol/L(NH4)2SO4，20m mol/ L MgSO4，200m mol/LTris-HCl(pH 8.8)， 1%TritonX-100， 1 mg/mLBSA

6.2.14 5×TBE緩沖液：Tris54g，硼酸275g，0.5mol/ L EDTA(pH8.0)20mL，加蒸餾水至1000mL。

6.2.15 10×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，40%蔗糖。

6.2.16 RNA酶(10μg/mL)。

6.2.17 UNG酶( Uracil N-glycosylase)。

更多標準內容請了解以下標準全文：

《SN/T 1196-2012 轉基因成分檢測 玉米檢測方法》