水質(zhì) 滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定 生物學檢測法
作者：lfb 時間：2022-11-21 來源：互聯(lián)網(wǎng)
警告：操作時應(yīng)按要求佩戴防護器具，做好無菌防護；實驗室操作需在無菌操作設(shè)備內(nèi)進行，避免吸入呼吸道或接觸皮膚和衣物。
1 適用范圍
本標準規(guī)定了鑒定水中滅菌指示微生物的生物學檢測方法。
本標準適用于經(jīng)滅菌處置的廢水中指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定。
2 規(guī)范性引用文件
本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。
GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法
HJ 494 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導
HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范
3 術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標準。
3.1
枯草芽孢桿菌黑色變種 Bacillus subtilis var. niger
在含酪氨酸的培養(yǎng)基上形成黑色色素的革蘭氏陽性芽孢桿菌，其營養(yǎng)細胞呈桿狀，單個或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。
4 方法原理
滅菌處置后的廢水通過孔徑為 0.45 μm 的濾膜過濾，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸選擇性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng) 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對特征菌落進行染色鏡檢和生化試驗做進一步鑒定，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽性芽孢桿菌，營養(yǎng)細胞呈桿狀，單個或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根據(jù)結(jié)果報告檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。
5 干擾和消除
5.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細胞內(nèi)的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1） 時加入硫代硫酸鈉溶液（6.13）消除干擾。
5.2 重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內(nèi)的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1）時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14）消除干擾。
6 試劑和材料
除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水應(yīng)滿足 GB/T 6682中三級水的要求。
6.1 酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基。
6.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
6.3 淀粉培養(yǎng)基。
6.4 硝酸鹽培養(yǎng)基。
6.5 甘油復紅肉湯培養(yǎng)基。
6.6 甘露糖生化培養(yǎng)基。
6.7 甘露醇生化培養(yǎng)基。
6.8 苦杏仁苷生化培養(yǎng)基。
6.9 革蘭氏染色液。
6.10 芽孢染色液。
注：6.1～6.10 的成分及制法詳見附錄 A，其中 6.2～6.10 也可使用市售商品化培養(yǎng)基或試劑。
6.11 硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）。
6.12 乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。
6.13 硫代硫酸鈉溶液：ρ=0.10g/ml。
稱取 15.7g 硫代硫酸鈉（6.11），溶于適量水中，定容至 100 ml，臨用現(xiàn)配。
6.14 乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ=0.15 g/ml。
稱取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉（6.12），溶于適量水中，定容至 100 ml，此溶液保質(zhì)期為 30 d。
6.15無菌濾膜：直徑 50mm，孔徑 0.45 μm 的醋酸纖維濾膜。
按無菌操作要求包扎，經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20min，晾干備用；或?qū)V膜放入燒杯中，加入實驗用水，煮沸滅菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需更換水洗滌 2～3 次。
6.16 石蠟質(zhì)封口膜。
6.17 無菌水：取適量實驗用水，經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。
7 儀器和設(shè)備
7.1 采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 ml 廣口玻璃瓶。
7.2 恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差 36℃±1℃。
7.3 高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。
7.4 pH 計：準確到 0.1pH 單位，或更高精度。也可使用 pH 比色管或pH 精密試紙。
7.5 顯微鏡：物鏡 10×倍、20×倍、40×倍，油鏡 100×倍，目鏡 10×倍或 15×倍。
7.6 分析天平：感量 0.0001 g。
7.7 培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。
7.8 過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。
7.9 接種環(huán)。
7.10 鑷子。
7.11 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可使用計量合格的可調(diào)式移液器。
7.12 量筒：100 ml。
7.13 三角瓶：100 ml。
7.14 酒精燈。
7.15 無菌操作設(shè)備：無菌室或超凈工作臺、生物安全柜。
注：移液管、采樣瓶、培養(yǎng)皿、三角瓶等玻璃器皿試驗前要按無菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器（7.3）121℃滅菌 20 min，烘干，備用。
8 樣品
8.1 樣品采集
點位布設(shè)及采樣頻次按照 HJ/T 494 和HJ/T 91 的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。
如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.13），以除去活性氯對細菌的抑制作用（每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14），以消除干擾（每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。
注：15.7 mg 硫代硫酸鈉（6.11）可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實際活性氯量調(diào)整。
8.2 樣品保存
采樣后應(yīng)在 2 h 內(nèi)檢測，否則，應(yīng) 10℃以下冷藏但不得超過 6 h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內(nèi)檢測。
9 分析步驟
9.1 方法程序
樣品中枯草芽孢桿菌黑色變種的鑒定程序見下圖 1。
注：“＋”表示反應(yīng)結(jié)果陽性，“－”表示反應(yīng)結(jié)果陰性。
圖 1 枯草芽孢桿菌黑色變種檢測流程
9.2樣品過濾
用滅菌鑷子（7.10）以無菌操作夾取無菌濾膜（6.15）貼放在已滅菌的過濾裝置（7.8） 上，固定好過濾裝置。將樣品充分混勻后取 100 ml（高濃度樣品可減少過濾樣品量或?qū)悠废♂專┏闉V，以無菌水（6.17）沖洗器壁 2～3 次。樣品過濾完成后，再抽氣約 5 s，關(guān)上開關(guān)。
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