生物物理學(xué)家Joerg Bewersdorf說，2006年是熒光顯微鏡學(xué)的奇跡之年。而與之相媲美的另一個(gè)年份是1905年，當(dāng)時(shí)愛因斯坦以相對(duì)論、量子論和原子物理學(xué)變革了物理領(lǐng)域。而這場(chǎng)顯微鏡學(xué)革命，則是由3篇論文組成的，科學(xué)家首次能窺見細(xì)胞內(nèi)部并追蹤單個(gè)分子的行為。

“每個(gè)分子是一臺(tái)機(jī)器，一臺(tái)納米機(jī)器。”Bewersdorf說。其中，蛋白質(zhì)是尤為復(fù)雜的分子，它們以多種方式彎曲纏繞，執(zhí)行細(xì)胞新陳代謝和生長需要的反應(yīng)。“我們感興趣的是，這些微型機(jī)器是如何整合在一起完成細(xì)胞機(jī)能的？”

長期以來，光學(xué)顯微成像技術(shù)的發(fā)展一直受制于一個(gè)物理*限值的約束，也就是德國物理學(xué)家、顯微技術(shù)專家恩斯特·阿貝在1873年提出的預(yù)言：光學(xué)顯微鏡的成像效果被認(rèn)為受到光的波長限制，無法突破0.2微米，即光波長1/2的分辨率*限，此后被稱為“阿貝分辨率”。

在能夠窺見細(xì)胞內(nèi)部之前，科學(xué)家對(duì)該問題并沒有清晰的答案。光學(xué)顯微鏡無法提供任何幫助，超越一定放大率后，衍射使得光線四散而非集中于一點(diǎn)。任何距離小于200納米或?qū)挾仁羌?xì)胞膜40倍的物體都會(huì)變成一個(gè)模糊點(diǎn)。使用電子顯微鏡制作的圖片能分辨精細(xì)結(jié)構(gòu)，但必須是靜態(tài)的，無法用于活細(xì)胞。

2006年，3個(gè)實(shí)驗(yàn)室各自采用相似策略克服了“衍射障礙”：利用專業(yè)的熒光探針分析樣本。這些探針能被有選擇地開啟，直到所有探針能在一系列圖像中被捕捉到。科學(xué)家能像印象派畫家利用顏色點(diǎn)構(gòu)建一個(gè)場(chǎng)景那樣將這些圖像制作成一張圖片。這3個(gè)技術(shù)——光敏定位顯微鏡（PALM）、熒光PALM（FPALM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM），能區(qū)分出相距20納米的目標(biāo)，產(chǎn)生單分子尺度的熒光照片。這些技術(shù)為研究人員插上前進(jìn)的翅膀。例如，Bewersdorf在美國耶魯大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室正為活動(dòng)在活細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)“照相”。

自2006年到現(xiàn)在的10年間，這3個(gè)技術(shù)掀起了技術(shù)和方法的革新浪潮。2014年，德國馬克斯普朗克學(xué)會(huì)生物物理化學(xué)研究所的Stefan Hell、美國霍華德·修斯醫(yī)學(xué)院珍妮莉婭法姆研究院的Eric Betzig和美國斯坦福大學(xué)的William Moerner提出的打破衍射*限的成像策略使他們成為諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主。研究人員目前正在制造更明亮的熒光探針，以便照亮未曾展現(xiàn)在人們面前的細(xì)胞進(jìn)程。

“令人興奮的是，這些技術(shù)讓觀察活細(xì)胞成為可能。”珍妮莉婭法姆研究學(xué)院Jennifer Lippincott-Schwartz說，“目前，使用熒光探針拍攝單個(gè)蛋白質(zhì)時(shí)機(jī)已經(jīng)成熟。”

更持久、更明亮

這3個(gè)超分辨率顯微鏡技術(shù)都是依靠綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）等化合物發(fā)出光線的。這些物質(zhì)的基因能被插入編碼細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因中。然后，生成的蛋白質(zhì)中則附著著熒光物質(zhì)，并通過發(fā)出熒光顯示其存在位置。

但這些技術(shù)均存在限制。一個(gè)大問題是，在被刺激其發(fā)光的激光徹底損壞前，這些探針只能發(fā)出*為有限的光。甚至在光褪色效應(yīng)發(fā)生前，探針的光已經(jīng)非常微弱了。

而這些探針的綜合版本有機(jī)染料，能發(fā)出更明亮的光，但卻無法編碼目標(biāo)基因，并插入細(xì)胞內(nèi)部。相反，它們通常與能找到蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合在一起。但這種組合使得探針過大，無法穿過細(xì)胞膜或干擾蛋白質(zhì)功能。“這些探針確實(shí)存在限制。”Bewersdorf說。

幸運(yùn)的是，革新正在出現(xiàn)。Bewersdorf團(tuán)隊(duì)正在與兩個(gè)團(tuán)隊(duì)合作研究可點(diǎn)擊化學(xué)探針：新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室的SNAP-tag和普洛麥格生物技術(shù)公司的HaloTag。這些技術(shù)包含一種能被編碼到興趣蛋白質(zhì)中的較短的靶序列和一個(gè)能通過簡(jiǎn)單化學(xué)反應(yīng)嵌入靶蛋白中的染色分子。Bewersdorf和同事已經(jīng)證明這兩種技術(shù)能使用有機(jī)染料作用于活細(xì)胞。

另外，研究人員還求助于量子點(diǎn)——納米級(jí)半導(dǎo)體。這種物質(zhì)不僅明亮且持續(xù)一個(gè)月甚至更久，還能與生物分子相連接。新墨西哥大學(xué)生物物理學(xué)家Diane Lidke在細(xì)胞傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中就使用了量子點(diǎn)。但量子點(diǎn)存在一個(gè)缺點(diǎn)：體積過大。市場(chǎng)上能買到的量子點(diǎn)都有一個(gè)殼，這讓其直徑大了15~25納米。與只有4納米寬的熒光蛋白質(zhì)相比，“它們太大太笨重了”。

這一缺點(diǎn)意味著研究人員很難將量子點(diǎn)放入細(xì)胞或其他緊密空間中，但能有效應(yīng)用于在細(xì)胞外基質(zhì)和膜結(jié)合蛋白中。在與其丈夫、該校物理學(xué)家Keith Lidke的合作中，Lidke開發(fā)出了多色、快速、單分子追蹤技術(shù)，能用量子點(diǎn)在定制顯微鏡中生產(chǎn)圖片。
打開細(xì)胞

穿越細(xì)胞膜是熒光顯微鏡面臨的*大障礙之一。“即便只有5納米厚，細(xì)胞膜已經(jīng)進(jìn)化了數(shù)十億年，以便隔離細(xì)胞內(nèi)外，而且，效果出奇地好。”伊利諾伊大學(xué)香檳分校生物物理學(xué)家Paul Selvin說。

Selvin的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出的量子點(diǎn)更小，直徑接近9納米。這一尺寸能讓他將量子點(diǎn)滑過神經(jīng)細(xì)胞之間20~40納米的空隙，信息傳導(dǎo)分子經(jīng)由這里向相鄰神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息。一旦進(jìn)入這里，量子點(diǎn)能束縛并突出幫助記憶形成的受體的存在。雖然Selvin并沒有將這些量子點(diǎn)植入活細(xì)胞內(nèi)，但他認(rèn)為這是可行的。

該實(shí)驗(yàn)室還計(jì)劃在細(xì)胞膜上穿孔，然后迅速密封起來，以避免破壞細(xì)胞。“我們能夠使用一種名為鏈球菌溶血素的細(xì)菌酶在細(xì)胞膜上鉆一個(gè)約5納米的微小孔洞。”Selvin說。這一寬度足以讓熒光蛋白質(zhì)通過，甚至是聯(lián)合了抗體的蛋白質(zhì)，以便尋找細(xì)胞內(nèi)部的目標(biāo)物體。之后，研究人員能利用尚未發(fā)表的方法在20分鐘內(nèi)修補(bǔ)這些孔洞。

另外，還有人擔(dān)憂，這些探針會(huì)干擾靶蛋白的功能。而約翰斯·霍普金斯大學(xué)生物物理學(xué)家Jie Xiao則提出了一個(gè)不會(huì)損傷這些蛋白質(zhì)的替代方案。

她的探針分子經(jīng)過基因修飾，并非附著在目標(biāo)分子上，它們被制作出來后，就立刻被一種酶劈開，并進(jìn)入細(xì)胞膜的一個(gè)特定位置。這就意味著它們不再攜帶靶分子的位置信息，但卻位于能對(duì)其進(jìn)行精確計(jì)算的位置，并由此獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)生的精確計(jì)數(shù)，同時(shí)，蛋白質(zhì)本身能自由發(fā)揮功能。Xiao將該技術(shù)稱為裂解共轉(zhuǎn)化活化（CoTrAC）。

“量化活細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平非常重要。”Xiao解釋道，“人們通常使用熒光指示出相對(duì)變化。”但其研究的基因調(diào)控蛋白質(zhì)*少，很難用超分辨計(jì)數(shù)成像。此外，這些蛋白質(zhì)的精確數(shù)字的細(xì)微變化也能判斷細(xì)胞狀態(tài)改變與否。

讓背景暗下去

除了更明亮，另一個(gè)讓探針脫穎而出的方法是降低背景亮度。德國波恩大學(xué)生物物理化學(xué)家Ulrich Kubitscheck表示，“細(xì)胞中也有擴(kuò)散的背景。”非靶蛋白甚至本身就有天然、暗淡的熒光，這就造成了背景噪音。如果減少背景噪音，圖像的清晰度就會(huì)提高。

因此，研究人員不斷改進(jìn)亮度策略。Kubitscheck實(shí)驗(yàn)室使用激光層照顯微技術(shù)生產(chǎn)一個(gè)非常細(xì)的精確聚焦光束，該光束能從側(cè)面穿過樣本。“我們建造了一些下部和四周透明的玻璃室。”他說。通過從側(cè)面而非頂部向樣本照射光線，該團(tuán)隊(duì)照亮了一個(gè)200~300納米厚的切片，并從下部對(duì)樣本進(jìn)行觀察。科學(xué)家利用這種方法，看到RNA分子經(jīng)過一種名為核膜孔的蛋白質(zhì)絡(luò)合物輸出，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在這里，它們開始指揮蛋白質(zhì)合成。

能進(jìn)行激光層成像的顯微鏡已經(jīng)商業(yè)化。具備專業(yè)知識(shí)的研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)組成，并開始定制自己的顯微鏡。

而下一代選擇性平面照明顯微術(shù)被稱為晶格光片顯微鏡，誕生自Betzig的實(shí)驗(yàn)室。項(xiàng)目合作者、珍妮莉婭法姆研究院細(xì)胞生物學(xué)家Zhe Liu說，該技術(shù)能產(chǎn)生300~500納米厚的照明平面，其優(yōu)點(diǎn)在于光點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。晶格能形成一個(gè)三維網(wǎng)格，照亮樣本的連續(xù)剖面。

總之，顯微鏡技術(shù)在生物學(xué)發(fā)展歷程中至關(guān)重要，尤其是早期顯微術(shù)領(lǐng)域的某些重要發(fā)現(xiàn)，直接促成了細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的突破性發(fā)展。隨著生命科學(xué)的研究由整個(gè)物種發(fā)展到分子水平，顯微鏡的空間分辨率及鑒別精微細(xì)節(jié)的能力已經(jīng)成為關(guān)鍵技術(shù)問題。光學(xué)顯微鏡的發(fā)展史就是人類不斷挑戰(zhàn)分辨率*限的歷史。