礦化（mineralization）由成骨細胞（osteoblast）介導。作為脊椎動物的一種基本過程，成骨細胞通過基質囊泡（matrix vesicle, MV）分泌礦物質前體。基質囊泡富含鈣和磷酸鹽，含有酸性蛋白等有機物質。

如今，在一項新的研究中，Tomoaki Iwayama及其在牙周病學、生物醫學研究、口腔科學、生物材料和口腔解剖學發展部門的同事們利用掃描電子輔助介電顯微鏡（scanning electron-assisted dielectric microscopy, SE-ADM）和超分辨率顯微鏡（super-resolution microscopy, SRM）在納米級分辨率下評估了礦化條件下的活的成骨細胞。根據他們的觀察結果，基質囊泡能夠與溶酶體一起運輸并通過胞吐作用加以分泌。Iwayama等人提供了溶酶體能夠在礦化的成骨細胞中運輸無定形磷酸鈣的證據。相關研究結果發表在2019年7月3日的Science Advances期刊上，論文標題為“Osteoblastic lysosome plays a central role in mineralization”。

在骨礦化的生理過程中，磷酸鈣晶體的沉積在胞外基質中發生，這是所有脊椎動物的一種基本過程。1967年，生物學家Clarke Anderson和Ermanno Bonucci利用電子顯微鏡分別在細胞外空間中可視化觀察了礦物相關顆粒。科學家們后來將這些顆粒識別為礦化納米囊泡或基質囊泡。在過去50年的基質囊泡研究中，生物學家們一直在努力了解基質囊泡形成和分泌的機制，這種機制在很大程度上仍然未知。

利用電子顯微鏡闡明活細胞的礦化過程是具有挑戰性的，這是因為用于電子顯微鏡觀察的樣品制備需要化學固定和酒精脫水這兩個步驟。這些步驟能夠誘導人工贗品，甚至溶解或除去不穩定的礦物質前體，并留下稱為“晶體幻影（crystal ghost）”的有機支架。盡管科學家們已成功地對固定和脫水組織進行電子顯微鏡成像來觀察骨中礦化膠原纖維的結構，但是為了研究礦物質前體，他們必須采用低溫電鏡過程來避免脫水，并且促進較小的標本*快地冷卻，此外，這種冷卻過程成本高昂。

為了克服當前研究工作中的這些局限性，Iwayama等人使用了一種稱為SE-ADM的新型顯微鏡系統。這種方法之前已實現了在無染色的水介質中對哺乳動物細胞進行納米級分辨率的高對比度的成像。

這些研究人員使用這種相同的技術（高分辨率SE-ADM）探究了在完整的成骨細胞中觀察基質囊泡的可能性，以了解基質囊泡運輸的生物發生機制。對于成骨細胞系，他們使用了在體外和體內具有較高成骨能力的小鼠成骨細胞系KUSA-A1。在適當條件下進行細胞培養后，他們利用SE-ADM觀察這些細胞以鑒定正常的細胞內結構。他們觀察到在成骨培養基中細胞生長4～10天后，基質囊泡與膠原原纖維排列一致，并且由于融合或顆粒生長，分泌的顆粒大小增加了，它們的大小與之前的報道的相一致，這就表明它們確實是基質囊泡。

在利用SE-ADM開展進一步研究后，這些研究人員注意到溶酶體途徑參與轉運和分泌腔內基質囊泡的過程與外泌體中的相類似。有趣的是，外泌體和基質囊泡都被歸類為具有相似大小的胞外囊泡；它們都可由成骨細胞分泌，并且在細胞間通信中具有共同的功能。

在下一步中，Iwayama等人探究了這些顆粒是否是含有鈣和/或磷酸鹽的基質囊泡。為此，他們將這些細胞在成骨培養基中培養了7天，并利用SE-ADM觀察它們，記錄到沒有小晶界面（crystal facet）的非常平滑的結構。這表明基質囊泡沒有結晶，仍然是無定形的，這也與之前研究中記錄的相一致。當在一氮化硅（silicon mononitride, SiN）膜上檢測基質囊泡時，這些研究人員觀察到對應于磷、鈣、碳和氧元素的尖峰。他們使用拉曼光譜證實了這一發現：基質囊泡中存在磷酸鈣。

這些研究人員還研究了低磷酸酯脢癥（hypophosphatasia）的影響。低磷酸酯脢癥是一種由Alpl基因（表達鏈堿性磷酸酶）編碼的疾病，在這種疾病中，成骨細胞在體外不會發生礦化。為此，他們使用CRISPR-Cas9基因組編輯技術對成骨細胞的基因組進行編輯，從而產生敲除Alp1 的成骨細胞克隆。當他們利用高分辨率SE-ADM檢測這些成骨細胞克隆時，他們并沒有觀察到基質囊泡，而且鑒于沒有對應于磷和鈣的尖峰，他們通過光譜分析進一步證實了這一點。

當Iwayama等人利用高分辨率SE-ADM直接觀察基質囊泡的產生和分泌之后，他們進一步研究了溶酶體參與基質囊泡的細胞內運輸以便觀察活的成骨細胞的礦化。他們在含鈣的成骨培養基中培養了這些細胞，并用LysoTracker對它們進行染色，以便檢測感興趣的細胞內組分。他們找到了與溶酶體相匹配的含有鈣黃綠素（calcein）的囊泡，這就表明溶酶體內的基質囊泡的生物發生是在它們與含有鈣黃綠素的囊泡融合在一起后進行的。他們隨后開展功能喪失和功能抑制實驗，以便進一步破解這些途徑，并在體外的活細胞礦化期間探究細胞內的作用機制。

科學家們之前已報道過，由于成骨細胞線粒體中存在電子致密的富含鈣和磷的顆粒，線粒體參與這種礦化過程。這一點可通過使用改進的冷凍技術觀察到。此外，還有報道指出溶酶體和線粒體之間的直接接觸具有功能意義。當Iwayama等人利用LysoTracker和MitoTracker對細胞進行染色，并在N-SIM結構化照明（N-SIM structured illumination）超分辨率顯微鏡（SRM）下觀察這些細胞內組分。他們觀察到大多數含有鈣黃綠素的囊泡位于線粒體附近，并且與溶酶體相匹配。在SRM時間推移成像（SRM-time lapse imaging）過程中，他們進一步獲得了含有LysoTracker的囊泡與位于線粒體附近的靜態的含有鈣黃綠素的液泡融合在一起時的圖像，這就證實了他們的假設。

通過這種方式，再結合對其他SRM系統和其他細胞系的觀察，Iwayama等人提出了一種礦化機制。在這種機制中，溶酶體在成骨細胞內的基質囊泡生物發生和運輸中起著重要作用。當成骨細胞在細胞質內運輸無定形磷酸鈣時，溶酶體參與運輸而不結晶是合理的。這些研究人員的目標是開展進一步的研究，以便了解基質囊泡的調控分子，并研究基質囊泡和外泌體是否具有相似的組成以及在它們的產生和分泌和功能上是否具有相似的機制。這項研究中使用的SE-ADM能夠以較低的成本安裝到現有的掃描電子顯微鏡設備中。這項研究中開發的工具將在納米水平上提供適用于所有科學領域的非侵入性的高分辨率成像。